объем фиксирующей жидкости должен не менее чем

При отсутствии специального стола с успехом может быть приспособлен любой стол (желательно с ящиками) с площадью рабочей поверхности не менее 60*120 см.

Если крышка стола не имеет специального покрытия, то его следует сделать из какого либо влагоустойчивого материала. Однако участок стола, предназначенный для непосредственной работы по приготовлению препаратов, в любом случае необходимо накрыть стеклом и расположить под ним небольшие (9*12см) листы белой или черной бумаги. Этим создается соответствующий фон, облегчающий работу с окрашенными (белый лист) и не окрашенными (черный лист) объектами. Рекомендуется также на оба листа нанести контуры предметного стекла с обозначением места расположения и размеров покровного стекла. Это простой прием позволяет рационально разместить на предметном стекле срезы в процессе из заключения.

Для того, чтобы удобнее расположить необходимое оборудование, следует иметь двухъярусную полку для реактивов, растворов и посуды, которая устанавливается либо перед работающим (вдоль заднего края стола), либо сбоку в зависимости от расположения стола относительно источника света.

В настоящем разделе дается описание лишь самых необходимых образцов.

ШИРОКОГОРЛЫЕ БАНКИ С ПРИТЕРТЫМИ ПРОБКАМИ различной вместимости от 50 до 200 мл– используют для составления гистологических батарей, предназначенных для подготовки кусочков тканей к заливке различными средами. Более крупные банки применяют для фиксации и хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях, обработки предметных стекол, приготовления нейтрального формалина и пр.

Вместо банок с притертыми пробками можно использовать небольшие хозяйственные банки с жестяными завинчивающимися крышками разного объема.

БЮКСЫ—небольшие круглые стеклянные стаканчики различного диаметра и высоты с шлифованными крышками

ЧАШКИ ПЕТРИ—широкие, плоские стеклянные чашки с крышками– пригодны для различных манипуляций ( окраска свободно плавающих и наклеенных на предметные стекла срезов, использование в качестве подставок под бюксы и т.д.).

МЕРНАЯ ПОСУДА– цилиндры и мензурки различной емкости (от 10 до 250-500 мл) воронки различных размеров.

ХИМИЧЕСКИЕ СТАКАНЧИКИ—круглые стеклянные стаканчики без крышек вместимостью 50-100 мл– находят широкое применение при проведение гистохимических реакций, окраски срезов наклеенных на стекла и т.д.

КОЛБЫ (плоскодонные) вместимостью от 50 мл до 2 л. Малые колбы применяют для приготовления и хранения растворов различных красителей, большие—под дистиллированную воду и прочие жидкости, расходуемые в больших количествах.

ПИПЕТКИ обычные (предназначенные для закапывания лекарств) используют для накапывания на срезы красителей и различных жидкостей, градуированные (вместимостью 0,1-100 мл) применяют для отмеривания малых количеств различных жидкостей. Можно использовать в настоящее время широко используемые автоматические пипетки различной вместительности.

ПОКРОВНЫЕ СТЕКЛА представляют собой тонкие (0,15-0,2 мм толщины) пластинки различных размеров. Служат для покрытия обработанных срезов, расположенных на предметных стеклах. Размеры покровных стекол выбирают в зависимости от площади объекта.

Инструменты, используемые в гистологической лаборатории, включает пинцеты, скальпели, кровоостанавливающие зажимы, корнцанг, шпатели, препаровальные иглы– прямые и изогнутые, металлические и стеклянные. Стеклянные иглы необходимы при импрегнации серебром, когда металлические иглами пользоваться нельзя,

Так же необходимо иметь спиртовку, волосяную кисточку для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальную бумагу, иголки, нитки, плотную бумагу для этикетирования материала, лейкопластырь и карандаш по стеклу.

ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Взятие материала, его фиксация и уплотнение.

Умерщвление экспериментальных животных

В лабораторной практике применяют ряд методов умерщвления экспериментальных животных: отсечение головы (декапитация), умерщвление при помощи наркоза, пропускание электрического тока через тело животного, введение в кровеносное русло воздуха (укол в сердце или внутривенно) или в плевральную полость эфира(хлороформа)

Выбор метода диктуется видом животного и целями исследованиями, но наибольшее распространение в лабораторной практике получили два первых способа умерщвления.

Отсечение головы (декапитация) является основным способом умерщвления мелких лабораторных животных (лягушки, мыши, крысы) и осуществляется с помощью ножниц.

Материалом для гистологического исследования могут служить кусочки органов экспериментальных животных. Полученный путем прижизненного иссечения у человека кусочков тканей( биопсия), трупный материал, мазки жидких исследуемых материалов (крови, костного мозга).

После умерщвления тело животного быстро фиксируют в положении на спине. Лягушек, тритонов, мышей и других мелких лабораторных животных фиксируют на дощечках, восковых или пробковых пластинках, прикалывая за растянутые в стороны лапки. Для фиксации средних и крупных лабораторных животных используют специальные станки или же изготовленные для этих целей доски (оцинкованные или окрашенные с вбитыми по краям крючками или гвоздиками для привязывания конечностей)

Техника вскрытия брюшной и грудной полостей для всех лабораторных животных одинакова. Однако у животных имеющих шерстный покров, вначале следует иссечь достаточно широкий кожный лоскут, чтобы избежать загрязнение внутренних органов. Для этого, захватив и приподняв ( с помощью хирургического пинцета) кожу нижней части стенки живота по средней линии, подрезают ножницами образовавшуюся складку по направлению к голове, срезая кожный лоскут на нужном протяжении.

Затем следует сменить ножницы (или очистить их от прилипшей шерсти) и удалить влажным тампоном шерсть, попавшую на образовавшуюся «дорожку».

ВСКРЫТИЕ БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ.

Нижнюю часть стенки живота приподнимают пинцетом по средней линии ( что бы не повредить органы), прорезают ножницами вход в брюшную полость, ввода туда одну из браншей( но обязательно тупую) и разрезают стенку кверху до грудины. Затем берут кровоостанавливающие зажимы, захватывают ими внутренние слои стенки живота вместе с брюшной и отворачивают кнаружи, раскрывая брюшную полость.

ВСКРЫТИЕ ГРУДНОЙ ПОЛОСТИ

Вскрытие производиться двумя разрезами через реберные хрящи по обе стороны от грудины снизу вверх. Образовавшийся костно-хрящевой лоскут удаляют.

Главным требованием при взятии материала являются: максимальное сокращение сроков взятия, минимальное травмирование тканей, создание оптимальных условий для фиксации.

Первое и второе требование обеспечивается хорошим освоением техники умерщвления и вскрытия, а также применением очень острых режущих инструментов (скальпель, бритва, ножницы).

При иссечении материала необходимо максимально бережно обращаться с тканями: участки органов, подвергшихся травмированию (например, при зажиме пинцетом) не следует оставлять для исследования.

Благоприятные условия для фиксации создаются правильным выбором размера фиксируемого материала, ибо необходимо обеспечить равномерное и сравнительно быстрое проникновение фиксирующей жидкости во всю его толщину. Поэтому нужно вырезать кусочки толщиной не более 5-10 мм. Поперечные же и продольные размеры не имеют столь важного значение и определяются задачами исследования.

Вырезание кусочков для фиксации является одним из ответственных этапов в приготовлении качественных микропрепаратов и исследовательской практике и, как правило, должно производиться самим исследователем.

Если необходимо приготовить гистологические препараты из стенки кишечника, иссекают нужный отрезок органа, ополаскивают его в изотоническом растворе хлорида натрия (что бы не высохла серозная оболочка), разрезают вдоль (напротив брыжейки) и накалывают с помощью игл на восковую или пробковую подушку в расправленном состоянии слизистой оболочкой кверху.

Взятие материала из легкого также имеет некоторые особенности, ибо легкое всегда содержит воздух и ткань его плавает, не погружаясь полностью в фиксирующую жидкость. Для полного погружения необходимо кусочек органа завернуть в марлю в месте с каким-либо грузом.

Задачи и правила фиксации

Существует ряд общих правил фиксации: 1) объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемого кусочка ткани; 2) фиксатор должен иметь доступ к фиксируемому материалу со всех сторон, по этому на дно сосуда кладут вату или кусочек фильтровальной бумаги или подвешивают кусочек на нитке; 3) продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, прежде всего от скорости проникновения фиксатора в ткань; 4) различные фиксаторы сохраняют различные структурные и химические компоненты клетки.

Большинство фиксаторов оказывает уплотняющее действие на обрабатываемый материал. Размер исследуемых кусочков должен быть таким, чтобы произошло полное его пропитывание в оптимальные для данного фиксатора сроки. В среднем для большинства фиксаторов берут кусочки толщиной 5-10 мм.

Различают фиксирующие средства (простые фиксаторы)и фиксирующие смеси (сложные фиксаторы)

Формалин является самым дешевым и распространенным фиксатором. В чистом виде представляет, светлую, сильно пахнущую жидкость, состоящую из 40% водного раствора формальдегида. Применяют преимущественно в виде 10% водного раствора, для чего часть формалина (т. е. 40% раствора формальдегида) разводят 9 частями воды. Приготавливают раствор обязательно на водопроводной воде, так как дистиллированная вызывает набухание тканей.

Широкое применение формалин получил благодаря ряду свойств:

а) высокой степени диффузии;

б) способности хороню сохранять форму, окраску и структуру исследуемого объекта;

в) оказывать длительное фиксирующее действие (до нескольких лет), существенно не ухудшая при этом качество материала;

г) хорошо сохранять жиры и липоиды.

Высокая диффузионная способность и незначительное осаждающее действие позволяют формалину довольно быстро и глубоко проникать в ткани, что позволяет фиксировать кусочки органа размером от 1 см и более, а при необходимости и довольно крупные органы целиком.

Срок фиксации тканей в формалине 24—48ч. Обычный формалин, как правило, содержит примесь метилового спирта и муравьиной кислоты, количество которой увеличивается под влиянием света.

При охлаждении формалина в растворе появляется муть, оседающая в виде белого осадка (параформальдегид). Такой же осадок наблюдается на стенках сосуда и при испарении формалина. Поэтому формалин следует хранить в темной плотно закрывающейся стеклянной посуде при температуре не ниже 9°С.

Нейтрализация формалина. Примесь в формалине муравьиной кислоты придает раствору слабокислый характер, что нежелательно при применении ряда методов исследования (некоторые гистохимические реакции, серебрение раствором нитрата серебра). Способ нейтрализации формалина довольно прост: в сосуд засыпают карбонат кальция (или карбонат магния) в таком количестве, чтобы на дне образовался слой толщиной 1,5—2 см. Затем наливают формалин, несколько раз энергично встряхивают и оставляют стоять 24—48 ч. В течение этого времени происходит нейтрализация раствора.

Побочные действия формалина. Длительное хранение препаратов в концентрированном растворе формалина придает тканям чрезмерную плотность, затрудняющую дальнейшую обработку и ухудшающую качество препарата. Устранить этот недостаток можно путем помещения материала на 2 недели в 1% раствор нитрата серебра или 10% раствор лимонной кислоты. Длительное хранение в 10% растворе формалина приводит также к набуханию объекта, что необходимо помнить при его измерении после фиксации. При фиксации формалином в препаратах нередко появляется темно-коричневый кристаллический осадок — результат взаимодействия формалина с находящимся в тканях гемоглобином. Его удаляют путем помещения неокрашенных срезов в 1—5% раствор аммиака или 70% этиловый алкоголь на различные сроки (от 5 мин до 4 ч). Затем препарат тщательно промывают и ведут дальнейшую обработку.

Следует постоянно помнить, что длительное действие паров формалина сильно раздражает слизистые оболочки. Смачивание кожи формалином оказывает дубящий эффект, а при повторных частых контактах вызывает сухую экзему. Поэтому перед препарированием формалиновые препараты помещают в слабо аммиачную воду (для устранения запаха) и работают в резиновых перчатках (при возможности под вытяжным устройством).

Этиловый спирт. фиксирующее действие осуществляется за счет отнятия у тканей воды и коагуляции белков. Несмотря на ряд отрицательных свойств спирта (сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворение и экстракция жиров и гемоглобина), он как фиксатор находит широкое применение в микроскопической технике. Это объясняется тем, что этиловый спирт осуществляет быструю фиксацию, не требующую обезвоживания тканей перед заливкой в парафин и целлоидин. Будучи химически неактивным веществом, спирт особенно пригоден при гистохимических исследованиях. В нем хорошо сохраняются такие вещества, как муцины, гликоген, мочевая кислота, железо, кальций, которые легко растворимьи в других фиксирующих жидкостях. Чаще применяют 96% и абсолютный этиловый спирт. Некоторые авторы рекомендуют также концентрации 80 и 90%. Время фиксации зависит от материала: для тонких пленок — 15—30 мин, для кусочков толщиной 3—4 мм — 2—4 ч. В связи с тем что спирт легче воды, она, экстрагируясь из тканей, опускается на дно. Поэтому под кусочки исследуемого материала нужно обязательно подкладывать толстый слой ваты. Излишнее пребывание препарата в спирте вызывает чрезмерное уплотнение ткани, что плохо отражается на последующей ее обработке. Для приготовления абсолютного спирта 96% спирт наливают на прокаленный сульфат меди, лишенный кристаллизационной воды и имеющий вид серовато-белого порошка. Отнимая воду от спирта, он приобретает синий цвет. Обезвоживание лучше проводить последовательно в двух или трех сосудах. При этом в последнем сосуде медь остается почти безводной и абсолютный спирт над ней может храниться долго.

3. АЦЕТОН. В последнее время все большее применение в гистологических лабораториях для гистохимических целей находит фиксация ацетоном благодаря простоте, возможности быстрой фиксации и сохранению после нее многих химических соединений, в том числе активности многих ферментов. Недостаток метода — нарушение тонкой цитологической структуры. Применять следует бесцветный (безводный) раствор. Фиксировать можно как кусочки тканей так и срезы. Приготовленные в криостате срезы расправляют кисточкой на предметном стекле, переносят в плотно закрытый стаканчик с холодным (5—10%) ацетоном и помещают в баню с сухим льдом или же в камеру криостата. Срок фиксации зависит от толщниы срезов (в среднем 5—10 мин можно хранить и несколько дней).

В настоящее время применение ее в чистом виде ограничено. Однако она служит исходным раствором для приготовления таких распространенных фиксаторов, как жидкости Ценкера, Орта, Максимова и др.

Бихромат калия 2,5 г

Сульфат натрия 1,0 г.

Вода дистиллированная 100 мл.

Для лучшего растворения бихромата калия рекомендуется подогревать воду.

Фиксация по Навашину—Крылову.

Фиксация этим методом дает хорошие результаты при окраске ядер и протоплазматических структур железным гематоксилином.

Состав фиксатора Навашина:

Хромовой кислоты 1% р-р. 10 мл

Кусочки толщиной 5 мм следует фиксировать 4—6 ч; затем тщательно промыть в проточной воде (24—36 ч) для удаления хромовой кислоты, остатки которой ухудшают окраску препаратов. Г. И. Крылов предложил перед промывкой проводить кусочки через несколько порций 5—10% формалина до прекращения желтого окрашивания раствора (формалин извлекает хромовую кислоту из тканей). Эта процедура сокращает сроки промывания в воде.

(формалин, спирт, уксусная кислота) Бродского.

Рекомендуется для изучения структуры тканей и количественного цитохимического анализа нуклеиновых кислот. Преимущество ФСУ перед фиксатором Карнуа в том, что формалин подавляет активность ферментов, разрушающих нуклеиновые кислоты (нуклеазы) в фиксируемых клетках, благодаря чему количественно лучше сохраняются ДНК и РНК.

Состав и способ употребления:

Кусочки тканей 2 х 2 или 2 х 3 мм; время обработки 1—4ч в зависимости от свойств объекта.

После фиксации кусочки промыть водой в течение 12 ч или (для цитохимических целей) в течение того же времени тремя сменами 70% спирта. Быстро обезводить и залить в парафин.

Рекомендуется как лучший фиксатор для гистохвмического выявления гликогена (особенно, где его мало, — центральная нервная система).

Первый раствор- Спирт этиловый 96%-100 мл., Нитрат меди-1,8 г., Нитрат кальция-0,9г., Формалин нейтральный-10 мл.

Кусочки органа (не более З х З мм) фиксировать З ч в первом растворе, затем перенести во второй раствор на З ч. Промыть в трех-четырех сменах 70% спирта по 2 ч. Залить в парафин или целлоидин.

ПРОМЫВАНИЕ, ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ЗАЛИВКА ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Успешная фиксация исследуемого объекта — лишь первое условие, необходимое для приготовления качественных микропрепаратов. Однако для того, чтобы добиться получения тонких срезов (в тысячные доли миллиметра), зафиксированный материал необходимо соответствующим образом подготовить: сделать достаточно плотным и в то же время нехрупким. Нужно придать ему такое состояние, чтобы при резке он не крошился и не деформировался, срезался тонкими ровными слоями. для этого ткань следует освободить от излишков фиксатора, обезвредить, пропитать и залить какой-нибудь уплотняющей средой.

Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата следует строго придерживаться правила постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани. После промывания кусочки подвергают дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации. Для проведения процедуры приготавливают необходимое количество бюксов или стаканчиков с притертыми крышками,(можно использовать не большие банки с завинчивающейся крышкой ) этикетируют их и заливают спиртами: 50, 60, 70, 80 и 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такой последовательный ряд сосудов получил название гистологической батареи.

Спирты нужной крепости приготавливают заранее по специальной таблице разведения из 96 или 95 % этилового спирта

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СПИРТОВ

Источник

• ← объем файла больше чем нужно но действия будут продолжены ch341a
• объем цилиндра равен 12 чему равен объем конуса →